深色有隔内生真菌（Dark Septate Endophytes，DSE）可以广泛定殖于植物根系，促进植物生长及养分吸收。然而，其代谢物作为植物生物刺激素的研究却较少受到关注。本研究通过分析链格孢菌（Alternaria sp.）的生长曲线及其胞外代谢物组分，探讨了DSE胞外代谢物对紫花苜蓿的促生作用，并对其生长特性进行了初步研究。结果显示，链格孢菌在1-8 d处于生长期，8-16 d进入稳定期。不同生长阶段的胞外代谢物组分存在显著差异。研究表明，添加DSE胞外代谢物可显著提高紫花苜蓿的生物量（P<0.05）。与对照组相比，DSE在生长8 d时表现出更高的生物量和养分利用率。进一步分析发现，毛蕊异黄酮7-半乳糖苷、1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]1-脱氧果糖、N2-果吡喃糖基精氨酸、己酸2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯、肯普苷B以及麦迪诺苷E6等化合物与紫花苜蓿生物量呈极显著正相关（P<0.01）。本研究将DSE胞外代谢物与植物及土壤性状相结合，为开发基于DSE胞外代谢物的植物生物刺激素提供了理论依据。
图1试验流程图
主要研究结果
1.DSE的生长特性：与DSE在MMN培养基生长过程中，发生明显的颜色变化。随培养时间的增加，DSE菌液逐渐从浅褐色（4 d）变成深褐色（8、12 d），直至黑色（16、20 d）。根据不同培养时间DSE生物量的变化，绘制出DSE的生长曲线。0-8 d，DSE一直处于生长期。4-8 d，DSE生长速度加快。从8 d开始，DSE生物量增长速度减缓，进入稳定期。DSE生长12 d，DSE生物量基本达到峰值。DSE培养16 d后，DSE生物量开始缓慢下降，进入衰亡期。
图2 DSE不同培养时间的颜色变化(a)，及其生长曲线(b)
2.DSE胞外代谢物组分类型的相关变化：用非靶向代谢组学技术对不同培养时间的DSE胞外代谢物进行分析，共筛选鉴定得到差异代谢物137个。由韦恩图可知，所有潜伏期共有95种代谢物。8和12 d不存在特定的代谢物，4、16和20 d分别存在不同于其他时期的代谢物有16、1和12种。胞外代谢物包括氨基酸，肽和类似物、有机氧化合物、脂质和类脂分子、有机杂环化合物、苯丙烷和聚酮化合物、核苷，核苷酸和类似物、苯甲酸化合物、有机硫化合物、生物碱及其衍生物、有机氮化合物和有机酸及其衍生物11种化合物。不同培养时间的DSE胞外代谢物种类占比相似。其中，氨基酸，肽和类似物、有机氧化合物、脂质和类脂分子、有机杂环化合物和苯丙烷和聚酮化合物占总化合物的90%左右。
图3不同培养时期DSE胞外差异代谢物占比
3.生物刺激素关键物质的筛选：通过相关性分析，筛选出具有极显著（P<0.01）正相关的6种化合物：毛蕊异黄酮-7-半乳糖苷，1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]-1-脱氧果糖，N2-果吡喃糖基精氨酸，己酸-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯，肯普苷B，麦迪诺苷E6。这6种化合物在培养8 d的DSE胞外代谢物中相对含量占比分别是5.6%，2.0%，1.5%，1.0%，0.6%，0.1%。
图4毛蕊异黄酮-7-半乳糖苷（a），1-[(5-氨基-5-羧基戊基)氨基]-1-脱氧果糖（b），N2-果吡喃糖基精氨酸（c），己酸-2-(4-甲基-5-噻唑基)乙酯（d），肯普苷B（e），麦迪诺苷E6（f）与紫花苜蓿生物量的线性回归关系PART.4
结论与展望
时间因素显著影响DSE生长和胞外代谢物组分变化。不同生长时间的DSE胞外代谢物组分具有显著差异。通过对DSE胞外代谢物组分进行LC-MS分析，共鉴定出137种化合物。以氨基酸，肽类化合物为主。在紫花苜蓿根际添加DSE胞外代谢物，可以促进紫花苜蓿生长和养分吸收。在盆栽条件下，添加培养8 d的DSE胞外代谢物对紫花苜蓿促生效果最明显，显著提高紫花苜蓿生物量、养分含量和养分利用率。基于非靶向代谢组学技术结合植物和土壤参数分析，推测DSE胞外代谢物主要通过直接被植物作为养分吸收，化学信号调节植物的养分吸收过程，刺激植物根系提高植物养分吸收能力，刺激植物根系分泌更多的酶活化土壤养分四种途径对植物产生促生作用。本研究表明DSE胞外代谢物可以作为植物生物刺激剂，但接下来仍需要充分了解其所含的组分对植物产生的养分吸收的分子调控，并对其进行野外更贴合实际环境的复杂因素下的研究。