1.6 FITC标记噬菌体检测沙门菌的检测参数确定
1.6.1 FITC标记噬菌体
将3 mL噬菌体(1.0×1010 PFU/mL)与60μL FITC(10-5 mol/L)混合，加入2.5 mL反应液(1×PBS∶DMSO=4∶1，pH=8.5)。由于FITC分子在酸性环境下会形成沉淀，因此要保持整个反应体系的pH在8.0~8.5。避光冰浴过夜后透析，选择截留分子为3 500 Da的透析袋，1×PBS避光透析，每隔12 h换一次透析液，透析48 h后取出并测定标记后噬菌体滴度。最后将纯化的FITC标记噬菌体溶液于4℃避光保存。
1.6.2 FITC标记的噬菌体吸附宿主的最佳孵育时间
取200μL FITC标记的噬菌体(8.5×109 PFU/mL)与200μL鸡白痢沙门菌C79-13(1.0×106 CFU/mL)分别加入1.5 mL离心管，共5个平行管，皆加入600μL灭菌LB液体，置于培养箱中37℃、200 r/min分别孵育5 min、10 min、15 min、20 min和25 min后取出，各管中皆加入500μL多聚甲醛，室温静置20 min后4℃、8 000×g离心10 min，弃去上清液，去除未与宿主菌结合的FITC-噬菌体。然后，用500μL PBS重悬沉淀，重复离心洗涤三次。在最后一次离心后，加入50μL PBS重悬。吸取重悬液5μL于载玻片上，在样品上滴加一滴SlowFade Diamond抗猝灭封片剂后盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察，根据观察结果判定FITC-噬菌体吸附宿主细胞的最适孵育时间。
1.6.3 FITC标记噬菌体的宿主特异性检测
复苏部分非宿主菌，并在37℃、200 r/min摇床过夜孵育，调整菌液浓度1.0×106 CFU/mL，重复1.6.2中步骤制备样品镜检，同时用PBS替代非宿主菌液作空白对照。
1.6.4 FITC标记噬菌体的检测限测定
以PBS作为空白对照，将浓度为1.0×106 CFU/mL的宿主菌菌液按10倍稀释，获得5个稀释浓度样本，分别为10 CFU/mL、102 CFU/mL、103 CFU/mL、104 CFU/mL、105 CFU/mL。用1.6.2步骤获得的FITC标记的噬菌体(浓度为9×109 PFU/mL)与上述各样本置于培养箱中37℃、200 r/min孵育15 min，以随机10个视野中出现1个及以上荧光噬菌体结合目标细菌后形成的荧光棒状物，判定为阳性检出，同时取样3组同浓度的宿主菌菌液重复检测进行验证，将最低阳性检出率大于95%的菌液浓度确定为FITC标记噬菌体的检测限。
2结果
2.1噬菌体分离、纯化、鉴定结果
以鸡白痢沙门菌C79-13为宿主菌，从污水中分离得到一株裂解性强、遗传稳定的噬菌体，并命名为PC79-13。该噬菌体在双层琼脂上侵染细菌可产生清晰透亮的空斑。由图1可知:噬菌体PC79-13是头部直径约60 nm的正二十面体，长尾，属于有尾噬菌体目长尾噬菌体科。
图1噬菌体PC79-13的噬菌斑(A)及透射电镜形态(B)
2.2噬菌体宿主谱
将实验室保存的三种血清的沙门菌12株及52株大肠杆菌，用双层平板琼脂法检验本实验分离到的噬菌体PC79-13是否裂解这些菌株，结果如表2所示。噬菌体PC79-13可裂解4株鸡白痢沙门菌，但不裂解任何一株大肠杆菌、肠炎沙门菌或鼠伤寒沙门菌。因此，噬菌体PC79-13可以初步判定为特异侵染鸡白痢沙门菌的噬菌体。
2.3噬菌体生物学特性相关结果
2.3.1最佳MOI
结果显示在MOI为0.01时，噬菌体PC79-13的效价达到1.4×1010 PFU/mL，为各MOI中最高。因此，噬菌体PC79-13的最佳MOI为0.01(图2)。
图2噬菌体PC79-13的最佳MOI
2.3.2一步生长曲线
根据最佳MOI(0.01)进行一步生长曲线测绘，结果显示，噬菌体效价在30 min前升高缓慢，在第30 min后出现爆发式增长，直至80 min左右上升速度减慢并逐渐趋于平衡稳定，最高效价达到3.9×1010 PFU/mL，平均裂解量为186 PFU/cell(图3)。
图3噬菌体PC79-13的一步生长曲线
2.3.3紫外线敏感性
噬菌体置于距紫外灯光源30 cm处，直接照射15 min，90%噬菌体仍然保持感染活性。继续照射15 min后，仍然有60%噬菌体保持感染宿主菌活性。持续照射45 min，噬菌体效价大幅度降低，从1010降低至104(图4)。
图4噬菌体PC79-13的紫外线敏感性
2.3.4热稳定性
根据热稳定性实验数据绘图(图5)可知:本株噬菌体对高温的耐受性较强，在50℃水浴90 min时仍然能维持108 PFU/mL效价，在80℃水浴30 min时完全失去活性，在20~50℃范围内能维持效价稳定在108 PFU/mL。
图5噬菌体PC79-13热稳定性
2.3.5 pH稳定性
由酸碱度对应效价实验结果(图6)可知，噬菌体PC79-13在pH为3.0~11.0时效价较为稳定，在pH为2.0时效价大幅度降低，在pH=13.0时彻底失去活性，在pH=7.0时效价最高，为5.0×108 PFU/mL。表明噬菌体PC79-13是一株对强酸、强碱环境有较高抵抗力的菌株，其最适pH为7.0。
图6噬菌体PC79-13的pH稳定性
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