2.5.2检测限测定
根据荧光显微镜镜下观察结果显示，在细菌浓度为10 CFU/mL时，在随机10个暗视野中仍可检测到1个及以上的荧光噬菌体结合目标细菌后形成的荧光棒状物(图11)。取三组相同细菌浓度进行再次标记检测验证，显示在10个随机视野中重复三次皆能看到荧光棒状物，检出率大于95%。因此，荧光标记的噬菌体PC79-13可视化检测其宿主菌鸡白痢沙门菌C79-13的检测限为10 CFU/mL。
图11 FITC-噬菌体侵染稀释至10 CFU/mL宿主菌液后荧光显微观察(1 000×)
3讨论
本研究从污水中分离出一株宿主特异性极强的烈性沙门菌噬菌体PC79-13，电镜观察显示其头部为二十面体，直径约为60 nm，属于有尾噬菌体，在双层琼脂平板可形成透明、边缘清晰的噬菌斑。根据生物学特性试验显示，该噬菌体宿主谱比同类型的汪祥燕等分离报道的鸡白痢沙门菌噬菌体窄，但也显示其极强的宿主特异性，为后续检测和实际应用奠定基础。同时，噬菌体PC79-13的最佳MOI为0.01，相较于廖彬如等研究的沙门菌噬菌体有更低MOI，表明噬菌体PC79-13需要更少噬菌体原料即可扩增出更多噬菌体，产能效率高。根据一步生长曲线显示其潜伏期为30 min，在80 min到达爆发期，平均裂解量为186 PFU/cell，远高于岑鑫等分离的烈性沙门菌，能高效、迅速地裂解宿主菌。另外，面对强酸强碱、紫外照射等恶劣环境，噬菌体PC79-13展现出良好的耐受力，在距紫外线30 cm处照射45 min后仍有活性，在pH为2.0~12.0时均有活性，酸碱耐受范围大于高瑶等分离报道出的肠炎沙门菌噬菌体，显示噬菌体PC79-13在恶劣生存和保藏环境仍能保持活性相对稳定。
根据对噬菌体PC79-13基因组进化分析可知其为长尾噬菌体科、肌尾噬菌体属的一株噬菌体，基因组总长度为86 886 bp，无明显的GC偏向性，在基因组水平上无毒力因子，临床应用无潜在风险。噬菌体PC79-13共预测了59个CDS，其中有23个CDS编码功能蛋白:包括1个参与表达噬菌体裂解酶的CDS，4个参与编码噬菌体结构、组装的CDS(如噬菌体尾丝蛋白、尾部卷尺蛋白、基板组装蛋白等)，16个参与编码噬菌体基因组复制、转录、蛋白质代谢的CDS(包括噬菌体相关DNA连接酶、DNA引物酶/解旋酶)，2个编码其他功能蛋白的CDS。噬菌体PC79-13基因组中还含有4个编码Ia类核糖核苷酸还原酶的CDS，有研究表明Ia类核糖核苷酸还原酶是基因复制、变异和修复的关键酶和限速酶。此外，基因组中还含有20个编码tRNA的CDS。
对于生物检测而言，基于生物识别和电化学信号转导相结合的平台，如生物电化学平台及实时荧光定量PCR等技术已被开发应用于病原体检测。相较于依赖相关仪器设备、检测周期长的检测方法，本研究探讨了FITC标记噬菌体制成生物探针以快速可视化检测宿主沙门菌的可能性。实验结果表明:FITC标记的噬菌体PC79-13探针仍然保持其侵染宿主菌的活性。PC79-13荧光探针与宿主菌混合15 min后，在荧光显微镜下可视化检测宿主沙门菌，检测限可达到10 CFU/mL，相较于目前研发的其他生物传感方法具有检测灵敏度更高、操作简易和时间短等优点，有潜力用于检测沙门菌临床样本。
4结论
本实验使用双层琼脂平板法分离筛选到一株宿主特异性强的沙门菌噬菌体PC79-13，对强酸、强碱环境耐受性强，对高温有一定耐受力，难以经紫外线照射灭活;最佳MOI为0.01，在第30 min后出现爆发式增长，直至80 min左右增殖速率减慢并逐渐趋于稳定，平均裂解量为186 PFU/cell;基因组全长86 886 bp，共预测了59个CDS。噬菌体PC79-13经FITC标记的荧光噬菌体探针检测宿主沙门菌，检测限达到10 CFU/mL，检测时间少于20 min，用于动物产品的检疫检验有很好的应用前景。
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