摘要：为明确调理牛排的优势腐败菌并筛选出抑菌性、专一性强的植物精油，通过传统培养基法结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术筛选出调理牛排的优势腐败菌，并通过抑菌圈、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度及细菌生长曲线，从丁香精油、豆蔻精油、黑胡椒精油中选出抑菌性最强的植物精油。结果表明：优势腐败菌为深蓝紫色杆菌（Janthinobacterium lividum）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）；丁香精油的抑菌圈直径均大于10 mm，2～4μL/mL的精油添加量就能明显抑制优势腐败菌的生长繁殖；豆蔻精油抑菌性稍弱；黑胡椒精油对3株优势腐败菌均无明显抑菌效果。
调理牛排烹饪简单、方便快捷、营养美味，备受消费者青睐，然而，在其加工及销售过程中，由于自溶酶和微生物的作用，会不断积累醛、酮、胺等有害物质，导致牛肉颜色、质地、气味发生劣变，不适宜消费者食用。在肉类微生物菌群中，优势腐败菌能够在低温和长时间贮藏条件下大量增殖，占据主导地位，最终导致食品腐败。
目前，传统培养基分离仍是筛选优势腐败菌最常见的方法，但其分离出的菌株往往不能代表微生物菌群的真实分布情况。聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术可以通过监测微生物菌群组成变化判断样本中的优势菌，常用于研究白酒酿造、陈醋醋醅、土壤中的微生物菌群结构及种群分析，但该技术无法检测出DNA含量＜1.5%的物种，在全面揭示菌群多样性上具有一定局限性。已经有学者通过MRS平板分离结合PCR-DGGE技术监测真空包装猪肉的贮藏期，得到了优势菌群（清酒乳杆菌）。因此，传统培养基结合PCR-DGGE技术确定调理牛排中的优势腐败菌，进行特异性防腐是解决其货架期较短的有效措施。
植物精油是从种子、花、茎、叶、果实中提取的具有特征香气的挥发性液体，具有很强的生物活性，可以抑制由肠沙门氏菌和大肠杆菌侵害及蛋白质和脂质氧化引起的食品腐败、变质，是天然的抗菌剂和抗氧化剂，常被用来替代合成防腐剂。Manjankattil等发现，在火鸡肉中添加辣椒精油能够有效抑制其生产和加工过程中的耐药沙门氏菌生长。Buckiuniene等用罗勒精油腌制牛肉糜，发现处理后的牛肉蒸煮损失和霉菌/酵母数量比值显著降低，牛肉品质得到显著提升。此外，Kasi等发现在花生油中添加具有强抗氧化活性（2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除能力）的生姜精油，能降低其受黄曲霉毒素污染的风险，并有效延长保质期。然而，植物精油对调理牛排优势腐败菌的抑菌性研究却鲜有报道。
基于此，本研究拟通过传统培养基法结合PCRDGGE技术验证调理牛排贮藏期间的优势腐败菌，并引入丁香精油（clove essential oil，CEO）、豆蔻精油（cardamom seeds essential oil，CSEO）及黑胡椒精油（blank pepper essential oil，BPEO），以期通过抑菌实验筛选出一种高效、精准抑菌的植物精油，为调理牛排的特异性防腐提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
冷鲜调理牛排（牧童村菲力牛排）购于石河子市友好超市。
PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基、LB肉汤培养基、MRS、STAA、CFC固体培养基、PCA技术琼脂培养基、VRBA结晶紫中性红胆盐培养基青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂（分析级）国药集团化学试剂有限公司；细菌DNA提取试剂盒（50 preps）、2×Taq Master Mix北京天根生化科技（化工）有限公司；CEO、CSEO、BPEO多特瑞商贸有限公司；Gel-Green DNA染色剂、TE缓冲液上海麦克林生化科技股份有限公司；1×TAE电泳缓冲液美国赛默飞世尔科技公司。
1.2仪器与设备
LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗机械厂；S100 Themal Cycler PCR扩增仪、UniversalHood11凝胶成像系统美国Bio-Rad公司；ZHWY-118落地普通型大容量恒温培养振荡器上海智城分析仪器制造有限公司；DCodeTM System DGGE仪孚约生物科技（上海）有限公司；C h e m i S c o p e 6100化学发光仪上海勤翔科学仪器有限公司；CX23LEDRFS1C生物显微镜奥林巴斯（中国）有限公司。
1.3方法
1.3.1腐败微生物的分离纯化
无菌条件下称取调理牛排20 g，放入装有180 mL生理盐水的均质袋中。密封后于拍击式均质器中破碎，每20 min停歇10 min，避免过热，重复2次。取1 mL原液进行梯度稀释，选取3个合适稀释度的样品分别涂布于各选择性培养基上培养。挑取培养基上大小、形状、颜色不同的菌落，通过平板划线法对其进行纯化，得到单一菌落。各选择性培养基的目标腐败菌和培养条件如表1所示。
表1调理牛排腐败菌的筛选培养基及培养条件
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