I型鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)是由I型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)引起的雏鸭的一种高度致死、快速传播的病毒性传染病。该病的特征为发病急、病程短、死亡率高。临床症状为痉挛、抽搐和角弓反张等，主要病理变化以肝脏肿大和斑点出血为特征，是目前危害养鸭业一种重要的传染病。
DVH首次报道于美国长岛，随后在许多国家和地区陆续报道了该病疫情。1965年，我国报道了第一例DVH疫情，之后我国大部分省市和地区均报道了该病。目前，DHV-1的分离和培养仍然只能通过接种鸭胚或鸡胚来实现。一般而言，DHV-1经过若干代次的培养后，均可以在鸡胚或鸭胚中得到良好的增殖，并达到较高的病毒滴度，这有利于DHV-1强毒株的致弱以及研制DHV-1减毒疫苗。但在研究DHV-1的致病机理和分子生物学等方面，却有一定的局限性。研究表明，良好的细胞培养模型是开展病毒基础研究的良好平台，本研究在建立的鸭胚成纤维细胞(DEF-h)系的基础上，用DEF-h培养DHV-1，并研究其在细胞中的蛋白表达和增殖规律，为研究DHV-1的致病机理及研制细胞灭活疫苗等提供参考。
1材料和方法
1.1病毒株及DEF-h细胞系
DHV-1 ZJ-08株由本实验室分离并保存；DEF-h细胞系是通过逆转录病毒包装体系将SV40的大T抗原整合到的DEF细胞染色体中，利用大T抗原的细胞转化功能而建立的稳定传代细胞系。
1.2主要试剂
rTaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司；FITC和HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DHV-VP1抗体和DHV-1多克隆抗体由本实验室制备并保存。
1.3病毒接种
DEF-h细胞将DHV-1 ZJ-08株研磨液(0.2 mL/孔)接种于单层的DEF-h细胞，37℃孵育1 h，弃病毒液，更换含10%FBS的新鲜培养基，在5%CO2，37℃条件下培养，观察细胞病变(CPE)。培养4 d后，收获细胞培养物，-80℃冻存备用。
1.4 RT-PCR检测
收集培养48 h的3代DHV-1 DEF-h细胞提取病毒RNA。用特异性引物进行反转录获得cDNA，以其为模板，用特异性引物DHVF：5'-GGGGATGACTGTGTTCTG-3'，和DHVR 5'-GGG TATCCCACAACACTA-3'进行PCR扩增。预扩增大小为471个核苷酸序列(6966 nt～7436 nt)。PCR反应程序：95℃5 min；94℃1 min、53℃1 min、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5间接免疫荧光检测
(IFA)将DEF-h细胞培养于35 mm培养皿中，接种第3代DHV-1。培养48 h后，用丙酮∶甲醇(1∶1)固定液4℃固定15 min。用5%脱脂乳37℃封闭30 min。以DHV VP1抗体(1∶200)为一抗，标记以山羊抗兔FITC-IgG(1∶1000)为二抗，进行IFA检测。
1.6 Western blot检测
将DHV-1细胞培养裂解物经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，用5%脱脂乳封闭4℃过夜，以抗DHV-VP1多抗(1∶200)为一抗，以山羊抗兔HRP-IgG为二抗(1∶5000)，通过DAB法显色进行检测。
1.7 DHV-1感染鸡胚试验
将30枚9日龄SPF鸡胚随机分为两组，每组各15枚。第1组接种DHV-1 ZJ-08株的细胞培养病毒液(P3)，第2组接种DHV-1 ZJ-08株适应鸡胚的尿囊液(CF5)，接种量为0.2 mL/只。在37℃条件下孵化6 d，统计病毒致死鸡胚的数量。
1.8一步生长曲线的绘制
将DEF-h细胞悬液接种至96孔细胞培养板(3×105个/mL)，接种第3代DHV-1100μL/孔，倍比稀释10-1～10-6，37℃2 h后，吸出病毒液，加入100μL完全培养基(含5%的胎牛血清)继续于37℃5%CO2培养箱中培养，观察CPE，并记录50%细胞产生病变的孔，根据Reed-Muench法计算不同时间点的半数组织感染量(TCID50)，并进行数据分析，绘制病毒在DEF-h中的一步生长曲线。
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