摘要：以64倍最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氨苄西林、环丙沙星、多粘菌素三种抗菌药物分别处理大肠杆菌ATCC 25922，去除药物后，保持原始菌株药物敏感性的存活菌株为持留菌株;另用浓度递增的亚致死量的三种抗菌药物培养基连续对大肠杆菌ATCC 25922进行分批培养，获得能够耐受一定药物浓度的抗药性增强的菌株，去除药物后，菌株稳定的MIC值仍显著高于原始菌株，为抗药菌株。以稳定的MIC范围为检测指标，比较原始菌株的持留菌株和抗药菌株后续的生长优势。结果表明：经过一段时间的混合培养，持留菌株在95%以上，数量上占绝对优势，说明持留菌株比抗药菌株具有更强的生长优势，由此引发对抗药性回复的重新思考，自然界中持留菌株的特性、形成及存在可能为抗药性的逆转预留了一条途径。
抗菌药物的发现和使用大大降低了细菌感染性疾病导致的死亡率，但随着抗菌药物的广泛应用，人类和动物病原菌的抗药性问题凸显并引起全球高度关注[1]。抗菌药物使用之初就有相关抗药性的报道，至今有关细菌抗药性的起源、发展和传播已有了相当的积累。研究表明细菌抗药性可以通过多种机制产生，如编码靶蛋白的基因突变、药物渗透降低、细菌外排泵的外排功能激活、靶蛋白旁路、非酶的靶位保护、酶靶位修饰等，细菌通过整合各种可能的机制形成抗药性表型，并且可遗传的抗药性能够通过可移动遗传因子进行水平转移[2]，尤其在抗菌药物选择压力下，越来越多的“超级细菌”逐渐产生，对人类健康造成巨大威胁[3]。
细菌的持留性（persistance）不同于抗药性，表型上，持留菌虽然也能够耐过远高于MIC的药物浓度得以存活，却保留了原始菌株的药物敏感特性。早在1944年，Bigger发现青霉素并不能完全杀死金黄色葡萄球菌，其中极小一部分可以存活，认为其表现为休眠状态、非可遗传表型[4]。抗菌药物可以杀死大部分细菌，但总有一小部分不能被抗菌药物杀灭，当这些存活的亚群在同样的抗菌药物条件下生长，会重复这种异质特性，这种现象叫做细菌持留性，存活的细菌叫做持留菌[5]。持留菌的形成机制尚不明确，目前已有的研究包括持留性相关基因如hipA[6]、毒素/抗毒素（TA）系统[7]和外排泵系统[8]等，与细菌抗药性一样，持留性也是多因素共同参与形成的。
持留菌和抗药菌的本质和形成机制不同，但共存于抗菌药物压力下的细菌群体中。在对持留菌的研究中，普遍认为持留菌在抗药性中起到了至关重要的“帮凶”作用，研究思路多为阻断持留菌的形成和阻止进入休眠状态[6-8]。而本文思路是从生态角度审视抗菌药物使用过程中，休眠的持留菌在抗药性回复中可能的作用及当去除药物后二者在菌群后续繁殖中各自发挥怎样的作用。在体外条件下采用氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素三种不同类型的常用抗菌药物，以不同方式对原始菌株进行处理，获得原始菌株的持留菌株和抗药菌株，比较其药敏特性和相同生态环境中的生长优势，并探讨持留菌存在的意义及其在抗药性回复中潜在的作用。
1、材料与方法
1.1试验材料
菌株：药物敏感性试验质控菌株大肠杆菌ATCC 25922，由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存。
試剂与药品：氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素，购自中国药品生物制品检定所，分析纯;MH液体培养基（MHB）、MH固体培养基（MHA），购自北京陆桥技术有限责任公司。
1.2试验方法
1.2.1 MIC测定根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建立的标准药敏方法，采用微量肉汤稀释法[9]，测定原始菌株、持留菌及抗药菌株对氨苄西林、环丙沙星、多粘菌素三种抗菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.2.2高药物浓度下获得持留菌株用微量肉汤稀释法测定
大肠杆菌ATCC 25922 MIC后，在96孔板上，将氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素的药物浓度分别设置为各种药物MIC的64倍（氨苄西林256μg/mL，环丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL），按照药敏试验方法的接种量接入稳定期大肠杆菌ATCC 25922，每种药做18个重复孔，37℃静置培养。分别于6 d内每天取3个重复样，将每孔液体共200μL全部取出，10 000 r/min离心5 min，用200μL生理盐水洗涤2次，加50μL生理盐水重悬后涂布MHA平板，培养24～48 h，计算菌落数，测定MIC。
1.2.3在递增的亚致死量药物浓度下分批传代
获得抗药菌株取大肠杆菌ATCC 25922接种于装有50 mL MHB的三角瓶中（接种量为1%，V/V），氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素的终浓度分别为各自的1/2 MIC，12 h后转接到下一个三角瓶中（药物浓度不变），培养12 h后再转接到药物浓度倍增的三角瓶中;药物浓度由1/2 MIC连续倍比递增至64倍MIC，每一浓度传代2次，第二次培养细菌生长后划线于含相同浓度药物的MHA平板，过夜培养，挑取生长良好的单菌落并测定MIC。然后将其在无药MHB中连续传代直至MIC稳定，获得一系列MIC稳定的抗药性增强的菌株。
1.2.4持留菌株与抗药菌株的生长曲线测定
将获得的原始菌的持留菌株和抗药菌株在岛津2500 UV-VIS光谱仪中37℃培养900 min，每15 min在线连续测量OD600，比较不同菌株的生长曲线是否存在差异。
1.2.5持留菌株和抗药菌株的MIC范围
分别选取氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素三种药物原始菌的持留菌株和抗药菌株，挑取单菌落分别接种于等体积的MHB中，以同样的条件振荡培养16～18 h，各取菌液1 mL稀释至适当浓度，涂布于MHA平板获得单菌落，各取100个单菌落进行MIC测定[9]，统计不同菌株各自的MIC分布范围。
1.2.6持留菌株和抗药菌株生长优势的比较
根据1.2.5中测定的MIC频率分布结果，选取各自MIC范围没有交叉的持留菌株和抗药菌株，等比例接种培养基混合培养，以各自MIC为检测指标统计二者组成比例的变化。具体方法：挑取氨苄西林、环丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗药菌株的单菌落，分别接种于MHB中，37℃、200 r/min振荡培养12 h，用MHB稀释，于紫外-可见光分析仪（GE Ultrospec 3100 pro）检测OD600，调节至0.08～0.10范围内，尽量调整稀释倍数使其最终达到相同的OD600值，确保小数点后两位相同。以此浓度各取500μL，同时接种于含有100 mL MHB的三角瓶中，等比例接种后混合振荡培养，每天取1 mL转接入新的100 mL MHB中，连续转移传代7 d甚至更长时间。每次培养后取混合菌液稀释至合适浓度，涂布获得单菌落100株，测定其MIC。以1.2.5中测定的MIC频率分布为指标，统计菌液中持留菌株和抗药菌株来源的大肠杆菌的比例。
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