2.结果与分析
2.1基本特性
2.1.1生长曲线
从图1中可以观察到细菌生长周期中的迟缓期、对数期和稳定期，6株芽孢杆菌的生长速率各不相同。在两个培养温度下，蜡样芽孢杆菌（C）和沙福芽孢杆菌（D）生长速率较快，在培养第3 h左右进入对数生长期；而在20℃培养温度下，地衣芽孢杆菌（J）生长速率较慢，第12 h左右才进入对数期且OD值较低；在37℃培养温度下，沙福芽孢杆菌（E）的生长速率较慢，24 h内生长曲线上升缓慢。
图1 20℃（A）和37℃（B）条件下6株芽孢杆菌的生长曲线（n=3）
蜡样芽孢杆菌（C）的生长情况与前人研究结果一致，在37℃培养条件下，前2 h处于滞后期，在6 h左右进入稳定期。在LB培养基中测定吸光度发现，蜡样芽孢杆菌的生长速度比地衣芽孢杆菌更快，说明蜡样芽孢杆菌有更强的生长能力，与本试验结论一致。
2.1.2产酸
本试验中以相同条件下空白组与菌株pH的差值体现菌株的产酸能力，表2与表3展示了在不同温度下6株菌48 h内的产酸情况。根据显著性分析，在20℃下培养48 h，蜡样芽孢杆菌（C）、高山芽孢杆菌（K）、沙福芽孢杆菌（E）和地衣芽孢杆菌（J）的pH变化显著高于其他2株菌（P<0.05），其中蜡样芽孢杆菌（C）和地衣芽孢杆菌（J）pH较空白组下降0.78；在37℃组中，培养至48 h的蜡样芽孢杆菌（C）pH下降值仍显著高于其他5株菌（P<0.05），为0.71。根据以上分析，蜡样芽孢杆菌（C）的产酸能力显著强于其他5株菌。
表2 20℃条件下6株菌产酸能力
表3 37℃条件下6株菌产酸能力
在不同温度下6株芽孢杆菌的产酸能力顺序并不完全一致，但总体来看，全部测试菌株都有较强的产酸能力；6株菌在生长过程中均会经历先产酸导致pH急剧下降，再回升保持pH在一个相对稳定的范围内的过程。用与本试验相同的培养基培养芽孢杆菌，同样发现芽孢杆菌生长过程中培养基溶液的pH下降。在研究香肠发酵过程中pH的变化时得出相似的结果，他们分析认为在细菌生长后期出现pH的波动可能是菌株内的蛋白酶分解蛋白质产生了碱性的代谢产物，这些代谢产物调节了培养基内的酸碱值，从而保证细菌生长环境的相对稳定。
2.1.3产气
如图2所示，所有菌株的Durham管内均无气柱产生；同时根据培养过程的观察，可以确定6株芽孢杆菌在培养过程中均没有气体产生。
2.2腐败酶活性
芽孢杆菌产生的蛋白酶会使蛋白质分解，引起食品的腐败变质。本试验采取液体法、乳粉琼脂平板法、熟鸡肉琼脂平板法三种不同的方法测定蛋白酶活。三种方法底物各不相同，可综合反映芽孢杆菌对于蛋白的腐败能力。
2.2.1蛋白酶
图3展示了6株芽孢杆菌的蛋白酶活力。液体法的反应底物为酪蛋白，通过比较蛋白酶活性数值可以初步判断6株菌的蛋白腐败能力。解淀粉芽孢杆菌（G）表现出的活力最强，为7.17 U/mL，沙福芽孢杆菌（D）的蛋白酶活相比于其他菌较低，为0.75 U/mL，其余4株菌的蛋白酶活在2.16~3.32 U/mL之间。根据试验结果可以初步判定解淀粉芽孢杆菌（G）的蛋白腐败能力最强。然而，液体法只能反映出6株芽孢杆菌对酪蛋白的分解能力。因此，在蛋白酶试验中，需要综合液体法和平板培养的结果，以判断不同菌株之间蛋白酶活力的差异。
图4展示了培养到5 d不同菌株在20℃和37℃的温度下在乳粉琼脂平板上分解圈面积与菌落面积的比值，以菌株在乳粉琼脂平板上的分解圈直径大小可反映细菌分解蛋白能力的强弱。乳粉琼脂平板法底物为脱脂乳粉，数据分析表明不同分离株的乳粉蛋白分解能力存在显著性差异（P<0.05）。在20℃条件下，分解圈面积/菌落面积的比值最大的是解淀粉芽孢杆菌（G），为17.36，分解圈面积/菌落面积的比值由大至小依次为解淀粉芽孢杆菌（G）、高山芽孢杆菌（K）、沙福芽孢杆菌（D）、沙福芽孢杆菌（E）、蜡样芽孢杆菌（C）。在37℃条件下，分解圈面积/菌落面积的比值最大的是高山芽孢杆菌（K），为9.64，分解圈面积/菌落面积的比值由大至小依次为高山芽孢杆菌（K）、解淀粉芽孢杆菌（G）、沙福芽孢杆菌（D）、沙福芽孢杆菌（E）、蜡样芽孢杆菌（C）。通过比较分解圈面积与菌落面积的比值大小，可以对6株菌株的蛋白分解能力进行排序。在乳粉琼脂平板试验中，解淀粉芽孢杆菌（G）展现出较强的蛋白酶活性。发现解淀粉芽孢杆菌的蛋白分解能力较沙福芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌更强，并计算得出解淀粉芽孢杆菌的蛋白酶活力为2.55±0.02 U/mL。
CJA的主要营养成分为熟鸡肉匀浆液，可以用于评估菌株对熟鸡肉中蛋白质的腐败的能力。试验所用的6株芽孢杆菌在CJA上的分解圈产生情况如图5所示。结果显示，在适宜的生长温度37℃下，经过10 d培养，所有接种至CJA的芽孢杆菌均未产生分解圈。通过计算，本试验中CJA的熟鸡肉添加量为12.5 mg/mL。而鸡肉煮制之后，营养物质会大量流失，因此仅以熟鸡胸肉为营养源制备的CJA平板中可供芽孢杆菌利用的营养物质含量低，仅可维持菌落生长却无明显分解圈产生。
图5 CJA分解圈
2.2.2脂肪酶
6株菌株在芽孢杆菌较适宜的生长温度37℃条件下培养48 h后全部呈阳性（图6），说明6株芽孢杆菌可产脂肪酶，具有脂肪腐败能力。芽孢杆菌作为一种常见的胞外脂肪酶来源，部分分离株已被证明具有很强的脂肪酶活力，并用于处理食品工业中富含脂肪的废弃物。先前的多项研究证明蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和高山芽孢杆菌具有脂肪酶活力，与本试验结论一致。
图6脂肪酶试验结果
2.2.3淀粉酶
图7展示了在20℃和37℃条件下培养5 d后，6株芽孢杆菌产生的最大分解圈面积数据。芽孢杆菌作为传统发酵食品中常见的优势微生物，常见于各种淀粉含量高的食品。SHEN等的研究证明芽孢杆菌具有较强的淀粉分解能力。在本试验的6株芽孢杆菌中，蜡样芽孢杆菌（C）、沙福芽孢杆菌（D）、高山芽孢杆菌（K）、解淀粉芽孢杆菌（G）和地衣芽孢杆菌（J）这5株芽孢杆菌展示出了淀粉分解能力。在20℃条件下，解淀粉芽孢杆菌（G）的分解圈面积最大，达到了2.30 cm2，说明在20℃的环境温度下，5株产淀粉酶的菌株中解淀粉芽孢杆菌（G）的淀粉酶活力最强；在37℃条件下，解淀粉芽孢杆菌（G）和地衣芽孢杆菌（J）的分解圈面积显著大于另外3株（P<0.05），解淀粉芽孢杆菌（G）的分解圈面积达到了16.53 cm2，地衣芽孢杆菌（J）的分解圈面积达到了16.61 cm2，说明在37℃的环境温度下，5株产淀粉酶的菌株中解淀粉芽孢杆菌（G）、地衣芽孢杆菌（J）的淀粉酶活力最强。
综合6株菌在两个温度下表现出的淀粉酶活力，6株菌株的淀粉分解能力最强的是解淀粉芽孢杆菌（G）。通过探究酒曲中不同芽孢杆菌的酶解能力，发现解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的葡萄糖淀粉酶活力高于蜡样芽孢杆菌，这与本试验结论一致。研究指出，解淀粉芽孢杆菌比蜡样芽孢杆菌等拥有更多的胞外淀粉酶和葡萄糖淀粉酶，因此具有更强的淀粉分解能力。
3.结论
在基本特性试验中，蜡样芽孢杆菌（C）和沙福芽孢杆菌（D）表现出较快的生长速率，在培养的第3 h进入对数生长期。蜡样芽孢杆菌（C）展现了较强的产酸能力，在20℃和37℃条件下，与空白组相比pH的下降值分别为0.78和0.71；大部分菌株都展现出了蛋白和淀粉腐败能力，其中解淀粉芽孢杆菌（G）的综合腐败能力最强，具体体现为蛋白酶活力为7.17 U/mL，蛋白酶分解圈面积/菌落面积比值和淀粉酶分解圈面积显著高于其他菌株（P<0.05）。
综合试验结果，本研究发现6株从腐败低温肉制品分离出的芽孢杆菌具有腐败异质性，体现出的生长速率、产酸、蛋白酶活力、淀粉酶活力等均不相同。而不同的理化特性对应不同的防治方法，后续研究中将深入探究芽孢杆菌的腐败机理，并研发更有针对性、更高效的芽孢杆菌控制方法，为提升肉制品安全提供保障。