2结果与分析
2.1生长曲线的测定结果
图1 2株肠道菌生长曲线
由图1可知，2株菌0～3 h均显示生长相对迟缓，6～24 h菌株呈指数生长，24～39 h菌数平稳，39 h后活菌数开始减少进入衰亡期。此外图1还显示2种菌在21 h之前的增殖速率基本相同，但从21 h开始进入生长平稳期间后，LJ-Q2较LJ-G1增殖速率快，39 h后LJ-Q2较LJ-G1衰亡速率快。研究结果对于后续发酵法制备雌马酚有实际参考作用。
2.2金属盐对肠道菌生长的影响
2.2.1不同浓度金属盐对LJ-G1肠道菌生长的影响
图2不同浓度金属盐对LJ-G1肠道菌生长的影响
由图2可知，5种金属盐的不同浓度对LJ-G1菌生长均有不同程度的影响，运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析得知：Na2CO3浓度在0.3 mol/L之前与对照组比其影响无显著差异（P＞0.05），不具有统计学意义，但0.5 mol/L与0.3 mol/L相比呈明显的抑制作用（P＜0.05）；CaCl2浓度0.1 mol/L与0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），浓度愈大抑制作用愈强，具有统计学意义；KNO3这5个浓度的影响比较一致；ZnSO4浓度为0.3 mol/L时抑制作用最小，0.3 mol/L分别与0.1 mol/L和0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义；MnSO4浓度为0.1 mol/L时抑制作用相对较小，与0.5 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义。由图2还可知，与对照组比较，5种金属盐对LJ-G1菌生长的抑制作用由弱到强依次为Na2CO3＜CaCl2＜KNO3＜ZnSO4＜MnSO4。
2.2.2不同浓度金属盐对LJ-Q2肠道菌生长的影响
图3不同浓度金属盐对LJ-Q2肠道菌生长的影响
由图3可知，5种金属盐的不同浓度对LJ-Q2菌生长也均有不同程度的影响。运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析得知：Na2CO3对LJ-Q2菌的影响结果同于LJ-G1菌；CaCl2浓度由0.1～0.3 mol/L抑制作用显著增强（P＜0.05），具有统计学意义；KNO3的影响与CaCl2相似；ZnSO4浓度0.1 mol/L与0.2 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，即浓度在0.2～0.4 mol/L之间抑制作用较小；MnSO4浓度0.1 mol/L与0.2 mol/L相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，浓度在0.2 mol/L时抑制作用相对较小，其后随浓度增大抑制作用更强。
总体来看，5种金属盐对2种产雌马酚肠道菌的生长均有抑制作用，最强的为MnSO4。在菌的培养增殖期间应防止金属污染。
2.3不同碳源对肠道菌生长的影响
图4不同碳源对肠道菌生长的影响
由图4可知，5种糖对两株菌生长促进作用的影响从大到小依次为：葡萄糖＞麦芽糖＞乳糖＞蔗糖＞果糖，与对照组相比葡萄糖最明显，其次是麦芽糖和乳糖。运用F检验的方法，对各种差异进行统计学分析，蔗糖的影响与对照组相比差异不显著（P＞0.05），不具有统计学意义，果糖的影响呈抑制作用与对照组相比差异显著（P＜0.05），具有统计学意义，与果糖不易被微生物分解有关，这可能是蔗糖影响作用不明显的缘故。大量体外研究表明，葡萄糖可作为肠道菌的有益碳源，而其他有害菌体不能利用或代谢利用率很低，这一结果可指导在以发酵法制备雌马酚时，添加葡萄糖作为营养物质，使产雌马酚菌增殖提高其产量。
2.4单因素试验结果
2.4.1葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响
图5不同葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响
在pH 7、NaCl质量浓度为4 g/L时，改变葡萄糖质量浓度分别为1、3、5、7、9 g/L，考察不同葡萄糖质量浓度对肠道菌生长的影响，结果见图5。LJ-G1和LJ-Q2菌株菌落数在葡萄糖质量浓度为1～7 g/L时呈上升趋势，当葡萄糖质量浓度为7 g/L时活菌数量值达到最大，此后随质量浓度增高，活菌落数快速下降，原因是渗透压升高，不利于菌的生长。葡萄糖对LJ-Q2菌的影响高于LJ-G1菌。
2.4.2 pH值对肠道菌生长的影响
图6 pH值对肠道菌生长的影响
在葡萄糖质量浓度为7 g/L、NaCl质量浓度为4 g/L时，改变pH值分别为4、5、6、7、8，考察pH值对肠道菌生长的影响，结果见图6。LJ-G1和LJ-Q2菌落数在pH 4～6时呈上升趋势，在pH值为7时达到最高，之后呈下降趋势，可以判定菌种在pH 7时是菌落的最适生长pH值环境，本结果符合正常人体肠道内为pH 6.8～7.3之间，在此范围选择不同水平进行正交试验。
2.4.3渗透压对肠道菌生长的影响
图7 NaCl质量浓度对肠道菌生长的影响
在葡萄糖质量浓度为7 g/L、pH值为7时，改变渗透压（NaCl质量浓度）分别为2、4、6、8、10 g/L，考察渗透压对肠道菌生长的影响，结果见图7。LJ-G1和LJ-Q2活菌数随NaCl质量浓度的升高而增大，NaCl质量浓度为4 g/L时达到最大，超过4 g/L之后活菌数明显呈下降趋势，且下降幅度较大。原因是随NaCl质量浓度的继续增高，会提高环境的渗透压从而使菌不能继续生长，由此可知NaCl适宜质量浓度为4 g/L左右。
从以上试验得到两种肠道菌3个因素最适水平范围一致，故生长条件的优化只选择LJ-Q2菌株进行试验。
2.5肠道菌生长条件的优化
表1肠道菌生长条件L9（34）正交试验设计方案及结果
由表1可知，根据极差计算得到因素主次顺序为：B＞C＞A，即pH值＞NaCl质量浓度＞葡萄糖质量浓度。计算分析因素水平优组合为A3B3C1，不同于正交试验中指标最高的第5组A2B3C1，经验证实验两组结果分别为11.52μg/mL与11.89μg/mL，显著差异（P＜0.05），具有统计学意义，确定优组合为A2B3C1，即葡萄糖质量浓度7 g/L、pH 7.2、NaCl质量浓度2 g/L。
表2方差分析表
由表2方差分析可知，B因素的F值大于F临界，这说明pH值对雌马酚产量的影响显著（P＜0.05）。A因素和C因素的F值均小于F临界，这说明葡萄糖质量浓度和NaCl质量浓度对雌马酚产量的影响不显著。
3结论
通过对从素食者粪便中分离出的产雌马酚LJ-G1和LJ-Q2两株菌生长特性的研究发现，生长规律为37℃厌氧条件下，培养6 h后进入指数期、21 h后进入生长平稳期、39 h后为衰亡期。MnSO4、ZnSO4、CaCl2、Na2CO3、KNO3对2株菌的生长均有不同程度的抑制作用，其中MnSO4的作用最强。在对菌生长有促进作用的糖中，葡萄糖最明显，其次是麦芽糖和乳糖。生长条件优化得出（按培养基体积计）葡萄糖质量浓度7 g/L、pH 7.2、NaCl质量浓度2 g/L，雌马酚产量11.89μg/mL。目前有关人体产雌马酚肠道菌生长特性研究的相关报道几乎未见到，今后还将依据素食者饮食特点在肠道环境方面，筛选影响产雌马酚菌生长因素水平，进一步优化指数期和延长平稳期培养条件，为其最终实现体外采用生物发酵法制备雌马酚奠定基础。
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