猪链球菌(Streptococcussuis)可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，严重危害着养猪业的发展。根据荚膜多糖抗原的差异，可将其分为35个血清型，即1～34及1/2型。对猪致病性较强的有猪链球菌1型、2型、7型和9型，尤其是猪链球菌2型，不仅对猪的致病性最强，而且可感染特定人群并致死，是一种重要的人畜共患病病原菌。本试验从我国部分猪场分离出1株2型猪链球菌，鉴定菌株7种毒力因子基因，并用分离菌株进行了小鼠致病性试验，以期为猪链球菌2型疫苗的研究提供必要条件和有利数据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源2014-2016年从全国部分猪场采集疑似猪链球菌感染病例脑样品，脑组织有明显的肉眼可见出血，共20份。
1.1.2猪链球菌培养基TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培养基购自BD生物科技有限公司。
1.1.3主要试剂新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司；革兰氏染液购自南京建成科技有限公司；引物合成及基因测序由擎科新业生物技术有限公司完成。
1.1.4细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.1.5试验动物18～22 g的昆明鼠，购自湖北省实验动物中心。
1.2方法
1.2.1细菌分离将采集的20份脑样品，分别于无菌操作台中使用接种环挑取部分组织，均匀涂划在加有5%新生牛血清的TSA平板中，于37℃条件下培养24 h，观察结果。24 h后于无菌条件下挑取平板上的疑似菌落划线接种于5%新生牛血清的TSA平板上，于37℃条件下培养24 h，观察细菌形态。
1.2.2 PCR鉴定
1.2.2.1 DNA提取用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，-20℃以下保存备用。
1.2.2.2 PCR引物选取猪链球菌属保守基因gdh(谷氨酸脱氢酶)，血清型特异性基因cas2J(荚膜多糖)以及7种主要毒力因子fbps(纤连蛋白原结合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相关因子)、mrp(溶菌酶释放蛋白)、89k(毒力岛)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和epf(胞外因子)基因，参考文献设计引物，引物序列见表1。
表1猪链球菌引物
1.2.2.3 PCR检测及测序分析PCR扩增体系：10×buffer 5.0μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL，引物P1(10μmol/L)1.0μL，引物P2(10μmol/L)1.0μL，模板DNA 2.0μL，Taq酶(5 U/μL)0.25μL，加注射用水至50μL；反应条件为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃终延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。用DNA回收试剂盒回收PCR产物，将该PCR产物连接pMD18-T载体，送擎科新业生物技术有限公司测序，并与BLAST上的相关序列比较分析。
1.2.3形态观察按常规方法对分离菌株进行革兰氏染色，普通光学显微镜下观察菌体形态特征。
1.2.4生长曲线的测定分离菌株接种TSB液体培养基，37℃培养8～10 h作为种子液。再将上述种子液按培养基总体积的2%接种TSB培养基，于37℃摇床170 r/min振荡培养。其间每隔2 h取样进行活菌计数，监测24 h。
1.2.5小鼠致病性试验采用半数致死量(LD50)评价分离菌的致病性，取30只雄性昆明小鼠，随机分为6组，每组5只，其中5组作为攻毒组，一组作为对照组。浓缩菌液，调整菌液初始浓度为1.0×1010CFU/mL，进行10倍倍比稀释，选取100～10-45个梯度，每个梯度攻毒一组小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水。连续观察14 d，记录各组死亡情况，对死亡小鼠立即解剖，观察病变情况，进行各脏器细菌分离、鉴定。根据Reed-Muench累加法计算分离菌株的LD50。
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