猪链球菌(Streptococcussuis)可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,严重危害着养猪业的发展。根据荚膜多糖抗原的差异,可将其分为35个血清型,即1~34及1/2型。对猪致病性较强的有猪链球菌1型、2型、7型和9型,尤其是猪链球菌2型,不仅对猪的致病性最强,而且可感染特定人群并致死,是一种重要的人畜共患病病原菌。本试验从我国部分猪场分离出1株2型猪链球菌,鉴定菌株7种毒力因子基因,并用分离菌株进行了小鼠致病性试验,以期为猪链球菌2型疫苗的研究提供必要条件和有利数据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源2014-2016年从全国部分猪场采集疑似猪链球菌感染病例脑样品,脑组织有明显的肉眼可见出血,共20份。
1.1.2猪链球菌培养基TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培养基购自BD生物科技有限公司。
1.1.3主要试剂新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司;革兰氏染液购自南京建成科技有限公司;引物合成及基因测序由擎科新业生物技术有限公司完成。
1.1.4细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.1.5试验动物18~22 g的昆明鼠,购自湖北省实验动物中心。
1.2方法
1.2.1细菌分离将采集的20份脑样品,分别于无菌操作台中使用接种环挑取部分组织,均匀涂划在加有5%新生牛血清的TSA平板中,于37℃条件下培养24 h,观察结果。24 h后于无菌条件下挑取平板上的疑似菌落划线接种于5%新生牛血清的TSA平板上,于37℃条件下培养24 h,观察细菌形态。
1.2.2 PCR鉴定
1.2.2.1 DNA提取用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA,-20℃以下保存备用。
1.2.2.2 PCR引物选取猪链球菌属保守基因gdh(谷氨酸脱氢酶),血清型特异性基因cas2J(荚膜多糖)以及7种主要毒力因子fbps(纤连蛋白原结合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相关因子)、mrp(溶菌酶释放蛋白)、89k(毒力岛)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)和epf(胞外因子)基因,参考文献设计引物,引物序列见表1。
表1猪链球菌引物
1.2.2.3 PCR检测及测序分析PCR扩增体系:10×buffer 5.0μL,dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL,引物P1(10μmol/L)1.0μL,引物P2(10μmol/L)1.0μL,模板DNA 2.0μL,Taq酶(5 U/μL)0.25μL,加注射用水至50μL;反应条件为:95℃预变性3 min,95℃变性30 s,退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环,72℃终延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳。用DNA回收试剂盒回收PCR产物,将该PCR产物连接pMD18-T载体,送擎科新业生物技术有限公司测序,并与BLAST上的相关序列比较分析。
1.2.3形态观察按常规方法对分离菌株进行革兰氏染色,普通光学显微镜下观察菌体形态特征。
1.2.4生长曲线的测定分离菌株接种TSB液体培养基,37℃培养8~10 h作为种子液。再将上述种子液按培养基总体积的2%接种TSB培养基,于37℃摇床170 r/min振荡培养。其间每隔2 h取样进行活菌计数,监测24 h。
1.2.5小鼠致病性试验采用半数致死量(LD50)评价分离菌的致病性,取30只雄性昆明小鼠,随机分为6组,每组5只,其中5组作为攻毒组,一组作为对照组。浓缩菌液,调整菌液初始浓度为1.0×1010CFU/mL,进行10倍倍比稀释,选取100~10-45个梯度,每个梯度攻毒一组小鼠,腹腔注射菌液0.2 mL,对照组腹腔注射0.2 mL生理盐水。连续观察14 d,记录各组死亡情况,对死亡小鼠立即解剖,观察病变情况,进行各脏器细菌分离、鉴定。根据Reed-Muench累加法计算分离菌株的LD50。
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