摘要:前期研究发现,随着病毒的不断传代,插入到鸭肠炎病毒(DEV)UL2基因中的报告基因绿色荧光蛋白(GFP)会发生点突变或缺失,严重影响了重组DEV的反向筛选。为筛选更加稳定的报告基因,通过酶切连接的方法以表达红色荧光蛋白(RFP)的表达盒取代重组质粒pT-UL2-GFP-gpt中的GFP-gpt表达盒,构建表达RFP的UL2基因缺失转移载体pT-UL2-RFP。该转移载体与DEV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)后,经克隆纯化获得表达RFP的重组DEV。通过测定重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线及用PCR测定不同代次重组病毒的RFP序列发现,重组病毒在细胞和上清中的病毒含量分别在48 h和84 h达到峰值106.4 TCID50/0.1 mL和106.83 TCID50/0.1 mL,与亲本毒无明显差异(P>0.05);RFP表达盒在重组DEV连续传12代后仍可稳定表达,表明在DEV UL2区域插入RFP表达盒不影响病毒的繁殖,且RFP表达盒比GFP表达盒更适合作为报告基因。该研究结果对重组DEV的构建、筛选具有重要意义。
鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)又称鸭瘟病毒,可引起鸭病毒性肠炎,是一种泛嗜性全身性感染的病毒,也是危害养鸭业最为严重的病原之一。该病毒对不同品种、年龄的鸭均可致病。患病鸭临床表现为急性败血症过程,其特征是血管损伤,体腔溢血,消化道出血、炎症和坏死等。
DEV属于疱疹病毒科马立克病毒属,具有基因组大、非必需基因多、遗传稳定性好等特性。这些特性使DEV作为病毒载体成为可能。以DEV为载体,已成功表达了小鹅瘟病毒VP2基因、新城疫病毒F基因、H5N1型高致病性禽流感病毒HA基因。在DEV基因组中插入报告基因可快速高效地筛选重组病毒。目前常用绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)以及β-半乳糖苷酶基因(LacZ)标记重组病毒。
孙莹等通过同源重组将GFP表达盒插入DEV UL2基因,筛选并纯化了表达绿色荧光蛋白的UL2基因缺失的重组DEV。但研究发现GFP在DEV中不能稳定表达,随着重组病毒的不断传代,GFP会发生点突变或缺失,因此有必要筛选更加稳定的报告基团。
本研究将带有RFP的UL2基因缺失转移载体pT-UL2-RFP与DEV共转染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF),经过5轮蚀斑筛选、纯化,获得表达RFP的重组DEV,通过测定重组病毒及其亲本毒的一步生长曲线以及用PCR测定不同代次重组病毒的RFP序列,以期获得更稳定的报告基因,为后期重组病毒的筛选奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自北京NEB公司;Ex Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司;胶回收试剂盒、质粒小提中量试剂盒等均购自天根生化科技(北京)有限公司;胎牛血清、M199培养液购自Hyclone公司;OPTI-MEM培养液购自Gibco公司;7.5%NaHCO3购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。
1.1.2菌(毒)株与细胞
DEV细胞适应毒以及重组质粒pT-UL2-GFP-gpt、pT-RFP由中国兽医药品监察所菌种保藏与检测室构建、保存;DH5α受体菌购自天根生化科技(北京)有限公司。
1.1.3 SPF鸡胚
购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。
1.1.4鉴定
引物ORFC17F:5’-ATGGCCGACG-ATAGGCT-3’,ORFC17R:5’-TTATACTGTTCCACAAGG-3’,由赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成。