1.4烟草青枯病菌对不同药剂的敏感性测定
采用生长曲线测定仪测定烟草青枯病菌对氟啶胺、双苯菌胺、噻霉酮、链霉素和春雷霉素的药剂敏感性。从烟草青枯病菌划线平板上挑取单菌落加入NA液体培养基中，振荡培养19 h，备用。将药剂按照体积比1∶100加NA液体培养基中，药剂浓度见表1。氟啶胺、双苯菌胺和噻霉酮以只加二甲基亚砜的NA培养液为对照，链霉素和春雷霉素以只加无菌水的NA培养液为对照。加样板每孔加入不同浓度药液3μL、营养肉汤250μL、青枯菌菌液50μL，每个浓度重复3次。加样板置入生长曲线测定仪上，于28~30℃、每隔30 min测定1次OD值。药剂对青枯病菌的生长抑制率计算公式：
表1不同杀菌剂单剂及复配药剂的浓度
以药剂浓度的对数为x轴，抑制率的机率值为y轴，根据两者间的线性关系，建立毒力回归曲线方程y=ax+b，并计算相关系数r和药剂对病原菌的有效抑制中浓度EC50。根据烟草青枯病菌敏感性的分布情况，建立青枯病菌对5种药剂的敏感基线。
1.5复配药剂的联合毒力测定
在单剂毒力测定的基础上，按氟啶胺分别与3种纳米农药按体积比80∶1、40∶1、20∶1、4∶1、1∶1、1∶4、1∶20、1∶40和1∶80共9个配比测定其对烟草青枯病菌的抑制率，复配药剂的终浓度见表1。采用Wadley方法对复配制剂进行联合作用评价，计算公式：
式中：a、b分别为氟啶胺与纳米农药的复配比例，%；EC50（a）为氟啶胺的有效抑制中浓度，μg/mL；EC50（b）为纳米农药的有效抑制中浓度，μg/mL。
式中：EC50（th）为混剂的理论有效抑制中浓度，μg/mL；EC50（ob）为混剂的实测有效抑制中浓度，μg/mL。
SR≤0.5，表明两种药剂复配具有拮抗作用；SR在0.5~1.5时，表明两种药剂复配具有相加作用；SR≥1.5，表明两种药剂复配具有增效作用。
2结果与讨论
2.1烟草青枯病菌的分离鉴定
从江西省宜黄、黎川、乐安、广昌、资溪和南丰等地区采集了烟草青枯病病样，分离培养后青枯病菌在NA培养基上生长的菌落表面光滑，呈不规则圆形，不透明、黏稠状且有流动性，见图1。将分离到的菌株采用烟草青枯病菌特异引物759/760进行PCR鉴定。结果（图2）表明，共有40株菌株基因组DNA的PCR扩增产物出现在预期位置（281 bp）。经NCBI数据库BLASTN比对，确认分离菌株为烟草青枯病菌。分离的烟草青枯病菌地理来源为崇仁县相山镇2株；黎川县4株，来自德胜乡、湖坊乡和潭溪乡；宜黄县5株，分别来自黄陂镇和二都镇；广昌县9株，来自头陂镇、旴江镇和长桥乡；南丰县10株，来自傅坊乡、太和镇和太源乡；资溪县2株，来自高阜镇；乐安县8株，来自招携镇和增田镇，见表2。
图1烟草青枯病菌在NA平板上的菌落形态
图2烟草青枯病菌的PCR鉴定电泳图
M.DL5000 Marker 2~40.烟草青枯病菌菌株编号（表2）
表2烟草青枯病菌菌株信息
2.2烟草青枯病菌生长曲线
选取4株烟草青枯病菌，在生长曲线测定仪上连续培养65 h，监测烟草青枯病菌的生长动态，并绘制烟草青枯菌的生长曲线。由图3可知，培养4~19 h时烟草青枯菌快速生长，处于对数生长期，19~38 h烟草青枯病菌的生长相对平稳，38 h后烟草青枯病菌开始逐渐衰亡。因此，在药剂毒力试验中，选定培养19 h左右的菌液，此时菌株生长活力较高，菌液OD600值代表烟草青枯病菌的生长量，可通过OD值来比较药剂处理对烟草青枯病菌生长的影响。
图3烟草青枯病菌的生长曲线
2.3烟草青枯病菌对氟啶胺的药剂敏感性
氟啶胺和双苯菌胺的作用机制为氧化磷酸化解偶联。烟草青枯病菌对氟啶胺的药剂敏感性（表3）表明，氟啶胺对供试菌株的EC50为0.147 1~0.890 4μg/mL，最大与最小的EC50之间相差6.05倍，平均EC50为0.305 0μg/mL，表明来自不同取样地的烟草青枯病菌株对氟啶胺的敏感性差异不大。其中，EC50最低和最高的菌株均来自乐安，来自其他地区菌株的EC50居于两者之间。烟草青枯病菌菌株对氟啶胺的敏感性频率分布呈连续单峰曲线（图4A），表明供试菌株对氟啶胺较敏感，可用于青枯病的防治。
表3烟草青枯病菌对不同药剂的敏感性
图4烟草青枯病菌对不同药剂的敏感基线
2.4烟草青枯病菌对双苯菌胺的药剂敏感性
从表3可以看出，烟草青枯病菌对双苯菌胺的敏感性较高，平均EC50为0.037 8μg/mL，且敏感性分布范围相对较窄，最大和最小EC50分别为0.018 7μg/mL和0.053 4μg/mL，两者仅相差2.86倍，分别来自黎川县和广昌县。从敏感基线（图4B）可以看出，烟草青枯病菌对双苯菌胺的敏感性呈单峰曲线分布，表明供试菌株对双苯菌胺敏感，未出现抗药性菌株。
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