马腺疫（strangles）是由马链球菌马亚种（Streptococcus equisubsp.equi，SEE）引起的一种以发热、精神沉郁、颌下及咽喉淋巴结脓肿等的临床症状[1]，且具有种属特异性的急性上呼吸道传染病，是最常见的马属动物的传染病之一[2-3]。马链球菌马亚种为链球菌属C群成员，革兰氏阳性，β溶血性链球菌，毒力基因包括透明质酸、肽聚糖、链球菌溶血素S等[4-6]，其中SeM蛋白是马链球菌马亚种重要的毒力因子，是细菌逃避吞噬作用和宿主免疫的重要保护性抗原，特异性高且高度保守，常被用来鉴定马链球菌马亚种[7-10]。
科学养殖、安全防控知识的缺乏导致驴感染马链球菌马亚种的病例时有发生[11]。现代规模化驴场对于疫病的防控除了对病原体检测和发病动物隔离治疗等措施外，场区内外的环境消毒及进出人员和动物的消毒是防控疫病发生最主要的措施之一[12]。消毒剂按杀菌效果分为高效消毒剂、中效消毒剂和低效消毒剂[13]。高效消毒剂包括卤素类消毒剂、氧化剂类消毒剂、醛类消毒剂；中效消毒剂包括含碘消毒剂、醇类消毒剂、酚类消毒剂；低效消毒剂包括季铵盐类消毒剂[14]。高效消毒剂可杀灭各类微生物，包含其芽孢；中效消毒剂可杀灭细菌繁殖体以及多数病毒和真菌；低效消毒剂可杀灭亲脂性病毒以及细菌繁殖体[15]。消毒剂的种类不同，杀菌机制也复杂多样。如何科学选择、使用消毒剂对于疫病防控极为重要。
2019年4月新疆石河子地区驴场发生一起疑似马腺疫疫情，为明确病原，了解驴源马链球菌马亚种的环境适应性及对消毒剂的敏感性。本研究对石河子地区发病驴场病原菌进行分离鉴定，并对分离株在不同培养条件下的生长特性及常用消毒剂的敏感性进行测定，以期对规模化驴场防控马腺疫提供参考。
1材料与方法
1.1病料来源
新疆石河子某驴场临床感染的驴及死亡驴颌下脓汁6份、肺部脓汁6份。
1.2试验试剂
BHI培养基购自青岛高科技海博生物技术有限公司；胎牛血清、牛血清白蛋白、卵磷脂购自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS、新洁尔灭、来苏水、碘附、84消毒液、吐温80、硫代硫酸钠购自北京市庆盛达化工技术有限公司；琼脂粉购自上海索莱宝科技有限公司；革兰氏染液购自珠海贝索生物技术有限公司；革兰氏阳性菌GP鉴定卡购自北京兰伯瑞生物技术有限公司；无水乙醇购自北京庆盛达化工技术有限公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。
1.3试验仪器
SW-CJ-2FD洁净工作台购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HVA-85 Hirayama高压灭菌器购自山东博科生物产品有限公司；48230V LabeyderPCR仪购自广州市粤行仪器有限公司；ZHWY-2102C恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；IS-RDV1立式单门双层全温振荡器购自广州市深华生物技术有限公司；VITEK2-compact30全自动微生物鉴定仪购自北京兰伯瑞生物技术有限公司。
1.4试验方法
1.4.1病原菌分离纯化及生化鉴定
取临床感染的驴和死亡驴肺部及颌下脓汁直接接种于含5%脱纤维羊血BHI培养基，置于37℃恒温培养箱培养24 h，挑取产生典型β溶血的菌落进行纯化。
1.4.1.1革兰氏染色
挑取鲜血培养基β溶血菌落，使用生理盐水制成细菌悬液，进行革兰氏染色。在油镜下镜检，观察其形态结构和染色特性。
1.4.1.2生化鉴定
挑取纯培养物，采用GP鉴定卡及VITEK2-compac全自动微生物鉴定系统进行生化反应鉴定。
1.4.2seM测序鉴定
用细菌基因组提取试剂盒提取分离株DNA，引物参考《马腺疫检疫技术规范》（SN/T 2977—2011）扩增马链球菌马亚种seM基因。F5′-CAGAAAACTAAGTGCCGGTG-3′，R5′-ATTCGGTAAGAGCTTGACGC-3′，由北京华大基因科技有限公司合成。PCR扩增体系（总体积为20μL）：Premix Taq10μL、DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、超纯水6μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性40 s，61.7℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增片段大小的确定，并进行回收测序。