2.7噬菌体ZX14的体外杀菌曲线
如图6所示，细菌培养对照组(NC)OD值于0~90 min明显增加，90~240 min进入平台期，OD值在1.6仅呈现微小波动。噬菌体ZX14与阴沟肠杆菌2025在不同MOI下混合，OD值先轻微增加后逐渐减少，减少速度与噬菌体数量成正比。不论噬菌体的MOI为0.1、0.01、0.001，在4 h后OD值均降在0.1左右，阴沟肠杆菌2025数量显著减少。
图6噬菌体ZX14体外杀菌曲线
2.8噬菌体ZX14宿主谱测定
对污水中筛选出的21种杆菌进行ZX14裂解性鉴定，结果显示噬菌体ZX14在路德维希肠杆菌52-5H、神户肠杆菌52-4H及阴沟肠杆菌52-3L的培养基平板上长出清晰噬菌斑，其余菌株的培养基平板未见长斑。表明噬菌体ZX14对52-5H、52-4H、52-3L具有裂解性，对其余18种杆菌无裂解性(表2)。
表2噬菌体ZX14宿主谱
2.9噬菌体ZX14比较基因组分析
2.9.1基因组圈图分析
噬菌体ZX14基因组是一种双链环状DNA，全长173 679 bp，GC含量为39.92%，与阴沟肠杆菌噬菌体vB_EclM_Q7622亲缘关系最为相近，覆盖率(coverage)及相似度(identity)均达到96%以上。预测ZX14具有294个ORF。预测结果显示，122个ORF与已知功能蛋白的基因相似(图7)，其中，64个与DNA代谢有关，39个与噬菌体结构蛋白有关，3个与噬菌体裂解有关，2个与噬菌体包装有关，剩余172个为假设蛋白(hypothetical protein)。
图7噬菌体ZX14(绿色)与6种相似噬菌体基因组的可视化基因组圈图
2.9.2同一性(ANI)分析
为了鉴定噬菌体ZX14与其他噬菌体基因组的相似性，首先在NCBI网站进行BLAST比对，结果显示，有8株噬菌体的核苷酸序列与ZX14的覆盖率高于70%，包括Q7622(96%coverage，96.62%identity;序列号:NC_070778.1)、305(91%coverage，95.44%identity;序列号:NC_070776.1)、IME523(91%coverage，95.50%identity;序列号:NC_070777.1)、Entb_45(88%coverage，94.70%identity;序列号:ON630910.1)、CIP9(90%coverage，94.63%identity;序列号:NC_048849.1)、ENC9(90%coverage，96.24%identity;序列号:OL355124.1)、PEi26(71%coverage，81.12%identity;序列号:AP014715.1)和PEi20(71%coverage，81.09%identity;序列号:NC_028683.1)，基于从NCBI数据库中检索到的全基因组序列，计算ZX14与最相似的前9个噬菌体之间的平均核苷酸同一性ANI值，并制作噬菌体ZX14的基因组热图，如同一性值所示(图8)，ZX14和肠杆菌噬菌体Q7622之间的ANI值最高，达到94.75%。
图8噬菌体ZX14与9种相似噬菌体基因组ANI分析热图
2.9.3末端酶大亚基系统发育分析
为了分析噬菌体ZX14的进化关系，对噬菌体ZX14进行系统发育树编辑和可视化。基于BLAST对比结果，利用编码终止酶大亚基的氨基酸序列构建噬菌体ZX14可视化系统发育树(图9)，并分析噬菌体的遗传关系。对比的18种噬菌体分别属于神奈川病毒属(Kanagawavirus)、卡拉姆病毒属(Karamvirus)、海尔德兰病毒属(Gelderlandvirus)、达卡病毒属(Dhakavirus)和胶大病毒属(Jiaodavirus)。其中，通过系统发育分析可以看出，ZX14与vB EclM Q7622等4种噬菌体同源性最高。vB EclM Q7622属于斜波病毒科(Straboviridae)，特文病毒亚科(Tevenvirinae)，神奈川病毒属(Kanagawavirus)。
图9噬菌体ZX14末端酶大亚基系统发育树
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