现代医学依靠抗生素通过破坏细菌细胞内的靶标来治疗细菌感染。一旦进入这些细胞，抗生素就会与特定酶靶标上的某些位点结合，从而阻止细菌生长。编码这些靶标的基因会自然发生随机变化（突变），在某些情况下会使抗生素难以附着在靶标上，从而使细菌产生耐药性。因此，随着时间的推移，抗生素使用得越多，细菌种群进化出对现有抗生素产生耐药性的突变体的可能性就越大，人们就越迫切地需要新的方法来防止抗生素治疗过时。几十年来科学家们一直在研究耐药性突变，希望通过相关机制来指导设计克服耐药性的新疗法。然而，这种努力一直受到限制，因为自然发生的耐药性突变只占可能发生的突变（完整的突变空间）的一小部分，而且迄今为止，大多数药物结合位点突变都被忽视了。为了应对这一挑战，来自美国纽约大学格罗斯曼医学院的研究人员应用了一种名为多重自动化基因组工程（Multiplex Automated Genome Engineering，MAGE）的技术产生了大肠杆菌中涉及抗生素利福平（rifampicin）结合的RNA聚合酶（RNAP）的全部突变清单，其中在这种细菌中，利福平附着在它的RNAP上并使其失效。研究人员利用自然界中存在的20种氨基酸的每一种分别替换了构成大肠杆菌利福平结合位点的38个氨基酸残基，从而制造出了760种独特的RNAP突变体。他们然后在包括利福平处理在内的不同条件下测试了这系列突变体的生长情况。这些发现L521Y和T525D这两种突变体对利福平非常敏感。这种抗生素不仅能阻止这些突变体生长，还能几乎消灭这两种突变细菌种群。
Bioscreen全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen用于监测不同突变体在利福平（Rifampicin）处理下的生长恢复情况。通过设置不同的时间点和处理条件，能够详细观察突变体在药物处理后的生长延迟和恢复情况。由于Bioscreen可以同时检测3个不同波长的OD值变化。这不仅能够监测微生物的生长曲线，还可以同时检测其他相关物质的生成或降解动态变化曲线。除了监测细菌的生长，Bioscreen C全自动生长曲线分析仪还可以同时检测抗生素对细菌生长的影响。Bioscreen能够在15°C至65.0°C的范围内精确控制培养温度，且温度变化的精度可达0.1°C。这使得研究者能够在不同的温度条件下进行实验，以评估温度对突变体生长的影响。在本研究中还用于评估不同温度下快速RNAP突变体的生长优势。研究发现，这些突变体在低温下生长更快，且在25°C时达到更高的OD值。
实验结果
研究者发现了一个α螺旋区域（rpoB 521-526），其中的突变可以显著增强或破坏利福平的结合。在这个区域，他们发现了单氨基酸突变体，这些突变体通过增加利福平的结合亲和力，将利福平从抑菌剂转变为杀菌剂，通过诱导致命的DNA断裂实现这一转变。这些致命的DNA断裂是复制依赖的，表明利福平通过在启动子处引起有害的转录-复制冲突来杀死细菌。发现了其他结合位点突变，这些突变大大增加了RNAP的速度。快速的RNAP耗尽细胞中的核苷酸，改变了细胞对不同抗生素的敏感性，并在低温下提供了生长优势。通过映射自然rpoB序列多样性，研究者发现，改变RNAP属性或赋予药物抗性的功能性利福平结合位点突变在自然界中频繁发生。一些对利福平超敏感的突变体，这些突变体在利福平存在下生长受到抑制，并且在DNA损伤修复突变体中对利福平的敏感性增加。这些RifHS突变体在利福平处理后显示出更高的DNA断裂水平，并且在缺乏双链断裂（DSB）修复机制的细胞中，利福平的杀菌效果增强。研究还发现了一些快速RNAP突变体，这些突变体对5-氟尿嘧啶（5FU）和双环霉素（BCM）敏感。这些突变体的RNAP具有更高的转录延伸速率和更低的暂停频率，导致细胞内核苷酸池的耗竭，从而增加了对靶向核苷酸生物合成的抗生素的敏感性。
图1、在Rif结合位点生成所有单个密码子替换。a，大肠杆菌RNAP的rpoB亚基内的Rif结合位点（蓝色），在下图中放大（PDB 5UAC）。b，突变池生成的示意图。MAGE寡核苷酸设计为在Rif结合位点内生成760个单密码子突变体（20个取代×38个位点）的饱和库。c，适应性筛选后在时间点0（T0）和时间点1（T1）生成的突变丰度的代表性热图。对于筛选数据的分析，通过计算log2（T1 fitness/T0）倍数变化，在T1和T0之间进行归一化。行对应于rpoB位置510–537和563–572;列对应于氨基酸。白色方块表示野生型残基。d，药物敏感性和耐药性筛选示意图。在LB中无法生长的突变体被指定为弱突变体，而仅在药物中无法生长的突变体被认为对药物敏感。通过将“T1药物”突变丰度标准化为“T1适应性”，即log2（T1药物/T1适应性），可以分离药物特异性作用。