1.2.5 entB基因缺失株分泌肠菌素试验
配制铬天青S(chromeazurolS，CAS)培养基，用于肠菌素的定性检测。将大肠杆菌亲本株(WT)和突变株(Mu1、Mu2)分别在LB肉汤中培养至D600nm值为1.0，在CAS琼脂板上打孔，每孔加入10μL菌液，置37℃培养24h后观察拍照。
1.2.6生长曲线测定
参考吕佩帅等方法测定菌株生长曲线，将大肠杆菌WT、Mu1、Mu2菌株分别接种至LB肉汤中培养，8000r/min离心2min收集菌体沉淀，经PBS洗涤2次后，调整菌悬液D600nm值为1.0，将菌悬液按1∶100比例分别接种至已添加LB和T-medium培养基的生长曲线培养板中。每隔1h测定D600nm值，每个样品设置2个平行孔，试验重复3次，取D600nm平均值绘制生长曲线。
1.2.7促生长试验
在MH固体培养基中进行大肠杆菌肠菌素对空肠弯曲菌的促生长试验。将空肠弯曲菌NCTC11168新鲜培养液以1∶250比例添加至50℃的MHA中，加入铁螯合剂DFO(终浓度为20μmol/L)混合均匀，倒入培养皿中凝固并打孔，将大肠杆菌AN102的WT、Mu1和Mu2菌株在T-medium中培养24h，离心取上清液，经0.22μm滤膜过滤后进行真空离心浓缩约10倍，在相应孔中加入10μL浓缩液，置三气培养箱(10%CO2，5%O2，85%N2)培养后观察菌株生长圈并拍照。利用大肠杆菌培养后的上清液接种空肠弯曲菌，测定对空肠弯曲菌的促生长作用，具体操作如下:利用上述过滤的大肠杆菌培养上清液(未浓缩)与添加铁螯合剂DFO(终浓度为20mol/L)的-m新ed鲜iuMmH替肉代汤培培养养上基清按液照作1∶为1对比照将新鲜培养的空肠弯曲菌NCTC11168菌液经Tmedium洗涤并重悬后，按1∶50比例接种至混合培养液中，置三气培养箱培养，分别在0、12、24和36h取菌液涂板计数。
1.3数据统计分析
试验数据通过Originpro2017软件进行计算，利用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析并作图，结果用平均值±标准差表示，P小于0.05表示差异显著，P小于0.01表示差异极显著。
2结果
2.1鸡肠道临床大肠杆菌分离株肠菌素的测定
对鸡肠道临床大肠杆菌分离株分泌肠菌素的水平进行测定，结果显示，30株大肠杆菌分离株均可分泌不同水平的肠菌素，培养上清中肠菌素浓度介于11~126μmol/L之间(图2)。
图2鸡肠道临床大肠杆菌分离株肠菌素测定
2.2 entB基因缺失株的鉴定
利用λRed同源重组系统构建大肠杆菌entB基因缺失株Mu1和Mu2，PCR扩增结果显示，亲本株扩增产物大小为1188bp，Mu1突变株扩增产物大小为1474bp，Mu2突变株扩增产物大小为510bp(图3)，片段大小与预期相符。
M，DL5000DNA Marker;1，亲本株WT;2，突变株Mu1;3，突变株Mu2
图3大肠杆菌entB基因缺失株PCR鉴定结果
2.3 entB基因缺失株分泌肠菌素的检测分别利用CAS试验和ic-ELISA方法检测大肠杆菌亲本株和突变株Mu1、Mu2分泌肠菌素的能力。CAS结果显示，大肠杆菌AN102和ATCC25922亲本株分泌肠菌素后琼脂由蓝色变为黄色，在接种环周围形成较大的黄色晕圈，而突变株Mu1和Mu2接种环周围黄色晕圈较小(图4)。ic-ELISA检测结果显示，大肠杆菌AN102和ATCC 25922亲本株中肠菌素浓度为100~150μmol/L，而突变株Mu1和Mu2中均未检测肠菌素(图5)。
图4 CAS定性检测肠菌素
图5 ic-ELISA定量检测肠菌素
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